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本试剂盒是一种为动物细胞死活检测提供双荧光染色的试剂盒。试剂盒内的两种探针可分别通过测定细胞内酯酶活性和质膜完整性来反映细胞活力。本试剂盒可用于荧光显微镜、流式细胞仪、酶标仪以及其他荧光检测系统。

本试剂盒可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞，包括贴壁细胞核的某些组织，不适用于真菌和酵母。该试剂盒与相同作用的台盼蓝相比，更快捷安全且灵敏度更高。

产品组成：

组分	150T	300T
Calcein AM原液(4mM in anhydrous DMSO)	50μL	100μL
PI原液(1.5mM in H2O)	250μL	500μL

保存：-20℃避光保存，六个月有效。
注意：
① Calcein AM容易水解，需密封干燥保存，稀释工作液需当天配制。
② 本试剂盒次数是按照流式细胞仪一个样品使用0.5mL工作液计算的。
③ 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

染料光谱特性：
Calcein AM：Ex/Em = 494/517nm
PI:Ex/Em (结合DNA)= 535/617nm

应用实例：


上图为Jurkat细胞使用本试剂盒的流式结果
Q2-UL：Cell Group with Calcein AM-,PI+(死细胞）；
Q2-LL：Cell Group with Calcein AM-,PI-(细胞碎片）；
Q2-LR：Cell Group with Calcein AM+,PI-(活细胞）。


上图为Jurkat细胞使用本试剂盒的免疫荧光结果
Cell:Jurkat
Green:Calcein AM
Red:PI

使用方法：

一、流式细胞检测

• 取出试剂，恢复至室温。
  
• 准备2μM Calcein AM和4.5μM PI的染色工作液：取出Calcein AM和PI原液，使其恢复室温。将30μL 1.5mM PI和5μL 4mM Calcein AM与10mL PBS或其他无血清缓冲液或培养基混合，涡旋混匀。上述工作液可直接用于细胞染色。
  
• 用1×PBS充分清洗细胞2～3次。
  
• 用0.5mL染色工作液悬浮细胞，控制细胞密度为1～5×10⁵/mL。
  注：我们推荐准备两管额外的样品，每管只加入一种染料（Calcein AM和PI），用于流式单染的补偿调节。
  
• 室温避光孵育15-20min。
  
• 在30min内，通过流式细胞仪检测细胞活性。Calcein AM可以由488nm激光激发，检测荧光发射光谱约在530nm处，PI发射光谱约在617nm处。
  注：细胞圈门时，注意排除细胞碎片，使用单染管调节补偿，双染管流式检测应获得两个相对独立的细胞群：显示绿色荧光的活细胞群和红色荧光的死细胞群。

二、荧光显微镜检测

• 准备2μM Calcein AM和4.5μM PI的染色工作液：取出Calcein AM和PI原液，使其恢复室温。将30μL 1.5mM PI和5μL 4mM Calcein AM与10mL PBS或其他无血清缓冲液或培养基混合，涡旋混匀。上述工作液可直接用于细胞染色。
  注：Calcein AM的水溶液易水解，应当天用完。Calcein AM和PI的浓度选择依据所用细胞类型不同而有所区别，推荐浓度范围为0.1～10μM。
  
• 准备细胞并开展实验。
  
• 对于贴壁细胞，可直接进行染色。对于悬浮细胞，离心收集细胞染色。
  
• 用1×PBS充分清洗细胞2～3次，以充分去除残留的酯酶活性。
  
• 吸弃PBS溶液，对于贴壁细胞，加入足够量的Calcein AM/PI染色工作液。对于悬浮细胞，加入适量的染色工作液，使细胞密度控制在1～5×10⁵/mL。
  
• 室温避光孵育15～20min (如果工作液浓度较高或者孵育温度较高，应适当的减少孵育时间)。
  
• 荧光显微镜下观察标记的细胞。
  

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